101

Chương 6

Enzyme

Enzyme là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng

hóa học. Chúng thúc đẩy một phản ứng xảy ra mà không có mặt trong sản

phẩm cuối cùng. Enzyme có trong nhiều đối tượng sinh học như thực vật,

động vật và môi trường nuôi cấy vi sinh vật.Hiện nay người ta đã thu được

nhiều loại chế phẩm enzyme khác nhau và sử dụng rộng rãi trong nhiều

lãnh vực như y học , nông nghiệp, công nghiệp...

6.1. Bản chất hóa học của enzyme

Ngoại trừ một nhóm nhỏ RNA có tính xúc tác, tất cả enzyme đều

là protein. Tính chất xúc tác phụ thuộc vào cấu tạo của protein. Nếu một

enzyme bị biến tính hay phân tách thành những tiểu đơn vị thì hoạt tính

xúc tác thường bị mất đi, tương tự khi bản thân protein enzyme bị phân

cắt thành những amino acid. Vì vậy cấu trúc bậc 1, 2, 3, 4 của protein

enzyme là cần thiết cho hoạt tính xúc tác của chúng.

Enzyme, cũng như những protein khác, có trọng lượng phân tử

khoảng 12.000 đến hơn 1000.000.Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những

phân tử L amino acid liên kết với nhau tạo thành, gọi là enzyme một thành

phần. Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành

phần. Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. Một

coenzyme khi kết hợp với các apoenzyme khác nhau (phần protein) thì

xúc tác cho quá trình chuyển hóa các chất khác nhau nhưng chúng giống

nhau về kiểu phản ứng.

Một số enzyme cần ion kim loại cho hoạt động như:

Cu2+

Cytochrome oxidase

Fe

2+

hoặc Fe

3+

Cytochrome oxidase, catalase, peroxidase

K+

Pyruvate kinase

Mg2+

Hexokinase, glucose 6-phosphatase,

pyruvate kinase

Mn2+

Arginase, ribonucleotide reductase

Mo Dinitrogenase

Ni

2+

Urease

Se Glutathione peroxidase

Zn2+

Carbonic anhydrase , alcohol dehydrogenase,

các carboxypeptidase A và B 102

Một số coenzyme và chức năng vận chuyển nhóm tương ứng của

chúng như sau:

Biocytin

Coenzyme A

5'- Deoxyadenosylcobalamin

(coenzyme B12)

Flavin adenine dinucleotide

Lipoate

Nicotinamide adenine dinucleotide

Pyridoxal phosphate

Tetrahydrofolate

Thiamine pyrophosphate

CO2

Nhóm Acyl

Nguyên tử H và nhóm alkyl

Điện tử

Điện tử và nhóm acyl

Ion Hydride (:H-

Nhóm Amino

Nhóm 1 Carbon

Aldehyde

6.2. Cơ chế tác dụng

Những quan điểm hiện nay nhằm giải thích cơ chế tác dụng của

enzyme đều cho rằng khi enzyme (E) tưong tác với cơ chất (S) sẽ làm

giảm năng lựợng hoạt hóa các phản ứng hóa sinh. Muốn làm giảm năng

lượng hoạt hóa các phản ứng enzyme cần trải qua nhiều giai đoạn trung

gian và tạo thành phức chất nhất định giữa E và S.

Khi kết hợp với phân tử enzyme, do kết quả của sự cực hóa, sự

chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các mối liên kết tham

gia trực tiếp vào phản ứng sẽ làm thay đổi động năng và thế năng nên

phân tử cơ chất trở nên hoạt động và dễ dàng tham gia phản ứng.

Việc tạo thành phức hợp E-S giai đoạn đầu xảy ra rất nhanh và rất

không bền. Do đó sau một thời gian dài mới được chứng minh bằng thực

nghiệm. Bằng chứng rõ ràng nhất về sự tồn tại của phức hợp E-S là thành

công của hai nhà hóa sinh Nhật Bản K. Iaglu và T. Ozava là tách được

phức E-S trong phản ứng khử amin bằng cách oxy hóa (loại trừ nhóm

amine) một amino acid dãy D do oxydase xúc tác.

Nhìn chung ta có thể hình dung cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ

chất tạo sản phẩm bằng phương trình tổng quát như sau:

E + S ' E - S P + E

Giai đoạn 1: E kết hợp với S để tạo thành E-S. Giai đoạn này xảy

ra rất nhanh, nhờ các liên kết không bền như liên kết hydro, tương tác tĩnh 103

diện, tương tác Van der Waals... Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện

khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.

Giai đoạn 2: Sau khi tạo phức, cơ chất có những biến đổi nhất

định về mật độ điện tử, cấu hình làm cơ chất trở nên hoạt động hơn, phản

ứng được dễ dàng để tạo thành sản phẩm P.

Trong nhiều phản ứng do enzyme xúc tác có 2 hay nhiều lọai cơ

chất, ví dụ hexokinase xúc tác phản ứng:

ATP + glucose hexokinase ADP + glucose 6 phosphate

Cơ chế enzyme xúc tác cho phản ứng 2 cơ chất có thể như sau:

a/ Cơ chế tạo phức 3 thành phần

S2

b/ Cơ chế không tạo phức 3 thành phần

Đây là trường hợp cơ chất thứ 2(S2) chỉ kết hợp vào enzyme ( ở

trạng thái E') sau khi P1 được tạo thành.

6.3. Trung tâm hoạt động (TTHĐ) của enzyme

Từ kết quả nghiên cứu về bản chất hoá học, về cấu trúc trung tâm

hoạt động , cơ chế tác động, về trung tâm hoạt động chúng ta có thể có

một số nhận xét chung về trung tâm hoạt động như sau:

- Là bộ phận dùng để liên kết với cơ chất.

- Chỉ chiếm tỉ lệ rất bé so với thể tích toàn bộ của enzyme.

- Gồm các nhóm chức của amino acid ngoài ra có thể có cả các ion

kim loại và các nhóm chức của các coenzyme. 104

Đối với E một thành phần: TTHĐ chỉ gồm những nhóm chức của

các amino acid như nhóm hydroxy của serin, carboxy của glutamic, vòng

imidazol... Các nhóm chức của các amino acid có thể xa nhau trong chuỗi

polypeptide nhưng nhờ cấu trúc không gian nên nó gần nhau về mặt không gian.

Đối với E hai thành phần: TTHĐ cũng như trên, các nhóm chức

của các amino acid tham gia tạo thành TTHĐ liên kết với nhau bằng các

liên kết hydro. Ngoài ra trong TTHĐ của loại này còn có sự tham gia của

coenzyme và có thể cả ion kim loại.

Theo Fisher TTHĐ có cấu trúc cố định, khi kết hợp với cơ chất để

tạo phức E-S ta có thể hình dung giống như chìa khóa và ổ khóa. Ngày

nay người ta đã chứng minh được rằng: TTHĐ của enzyme chỉ có cấu tạo

hoàn chỉnh khi có sự tương tác với cơ chất (thuyết tiếp xúc cảm ứng của

Koshland).

6.4. Tính đặc hiệu của enzyme

Người ta chia tính đặc hiệu ra làm 3 kiểu:

+ Đặc hiệu phản ứng

+ Đặc hiệu cơ chất

+ Đặc hiệu không gian

a/ Đặc hiệu phản ứng: Đó là biểu hiện của một enzyme chỉ

thường xuyên xúc tác cho một kiểu phản ứng nhất định, ví dụ vận chuyển

hydro từ chất cho (rượu bậc nhất hay rượu bậc hai) đến chất nhận (NAD+

hay NADP+) hay chuyền nhóm amin từ một amino acid đến một ceto

acid. Các phản ứng loại thứ nhất do dehydrogenase xúc tác, còn phản ứng

loại thứ hai do aminotransferase xúc tác. 105

b/ Đặc hiệu cơ chất: Tuỳ mức độ người ta chia thành: đặc hiệu

tương đối và đặc hiệu tuyệt đối

+ Đặc hiệu tuyệt đối: Enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất

định, một ví dụ có tính chất kinh điển về chuyên hoá tuyệt đối là urease,

enzyme chỉ phân giải ure:

Hằng trăm thí nghiệm trên các dẫn xuất của ure đều cho thấy

chúng không bị phân giải dưới tác động của urease. Thực ra người ta đã

phát hiện khả năng phân giải cơ chất hydroxyure nhưng với tốc độ bé hơn

khoảng 120 lần.

+ Đặc hiệu nhóm tuyệt đối: Các enzyme này chỉ tác dụng lên

những chất có cùng một kiểu cấu trúc phân tử, một liên kết và có những

yêu cầu xác định đối với nhóm nguyên tử đối vơi nhóm nguyên tử ở gần

liên kết chịu tác dụng. ví dụ : maltase chỉ phân giải liên kết glucosidic

được tạo thành từ glucoside của glucose với -OH của monose khác.

+ Đặc hiệu nhóm tương đối: Các enzyme không có những yêu cầu đối

vơi nhóm chức ở gần liên kết chịu tác dụng. ví dụ lipase thuỷ phân lipid.

c/ Đặc hiệu không gian: Các enzyme chỉ xúc tác cho một dạng

đồng phân nào đó như dạng L hay dạng D, dạng cis hay trans mà thôi.

6.5. Các yều tố ảnh hưởng đến tốc độ của phản ứng enzyme

6.5.1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện dư thừa cơ chất, nghĩa là [S] >>>[E] thì tốc độ

phản ứng phụ thuộc vào [S], v= K[E] có dạng y = ax. Nhờ đó người ta đã

đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzyme đó xúc tác.

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất kìm hãm hay

hoạt hoá thì vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến

tính với [E] đó.

v

[E]

Hình 6.1: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]

6.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [S]

Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất : chỉ một cơ chất. 106

(1)

Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.

Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES để tạo thành

E và S

Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).

v1 = k1[E][S]

v-1 = k-1[ES]

v2 = k2[ES]

Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:

k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S]

(k-1+k2)[ES] = k+1[E][S] (2)

Gọi E0 là nồng độ ban đầu:

[E0]=[E]+[ES]=>[E]=[E0]-[ES] (3)

Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:

(k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S]

k1 [E0] [S]

[ES] = --------------

k-1+ k2+k1[S]

Nếu đặt Km= k-1+k2/ k1

(Km: gọi là hằng số Michaelis Menten).

Ta có : [ES] = [E0][S]/ Km+[S]

Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:

V = k2[ES]

Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:

k2[E0] [S]

v = ----------------- (4)

Km + [S] 107

Qua đây ta thấy nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng

enzyme càng lớn. Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ

chất, nghĩa là:

Vmax= k2[E0]

Thay vào phương trình (4) ta được:

[S]

v = Vmax ---------- (5)

Km+ [S]

Phương trình (5) gọi là phương trình Michaelis Menten.

Km gọi là hằng số Michaelis Menten đặc trưng cho mỗi enzyme

Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số

càng nhỏ thì ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của

phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn.

[S]

Hình 6.2. Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất.

Khi tăng [S] thì v phản ứng tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì v

đạt đến giá trị vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S].

Khi Km=[S] thì v =1/2 Vmax

Năm 1934. Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã

nghịch đảo để biến thành dạng đường thẳng y=ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối

với việc nghiên cứu kìm hãm enzyme.

108

1/v

1/Vmax

-1/Km

1/[S]

Hình 6.3: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo

Lineweaver-Burk

6.5.3. Ảnh hưởng của chất kìm hãm (inhibitor)

Là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn

khả nâng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Kìm hãm enzyme có thể

thực hiện bằng nhiều cách khác nhau (thuận nghịch hay không thuận

nghịch). Thuận nghịch có:

Cách 1: Kìm hãm cạnh tranh (competitive inhibition)

Trong trường hợp kìm hãm cạnh tranh là cơ chất và chất kìm hãm

đều tác dung lên trung tâm hoạt động của enzyme, Chất kìm hãm choán

chổ của cơ chất ở enzyme.

Hình 6.4. Kiểu kìm hãm cạnh tranh

Khi cơ chất dư thùa, nồng độ chất kìm hãm thấp thì có thể loại

bỏ tác dụng của chất kìm hãm, còn nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất

kìm hãm cao thì lại có tác dụng kìm hãm hoàn toàn.

1/v= (αKm/Vmax) 1/S +1/Vmax α = 1+[I]/KI

109

1/v

[I]

1/Vmax Không có chất kìm hãm

1/[S]

Hình 6. 5. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo

Lineweaver-Burk khi có kìm hãm cạnh tranh

Người ta thấy kìm hãm như vậy phần lớn xẩy ra giữa chất kìm

hãm và cơ chất có sự tương đồng về mặt hoá học. ví dụ: malic acid có cấu

trúc gần giống với succinic acid nên kìm hãm cạnh tranh enzyme

succinatedehydrogenase, là enzyme xúc tác cho sự biến đổi succinic acid

thành acid fumaric acid.

Trường hợp đặc biệt của kìm hãm cạnh tranh là kìm hãm bằng sản

phẩm. Trường hợp này xẩy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại

enzyme và choán vị trí hoạt động ở phân tử enzyme.

Đường thẳng có chất kìm hãm thì có độ xiên lớn hơn và cắt trục

tung ở một điểm là 1/Vmax

Cách 2: Kìm hãm phi cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Đặc trưng của kiểu kìm hãm này là chất kìm hãm chỉ liên kết với

phức hợp ES, mà không liên kết với enzyme tự do.

110

Hình 6.6. Kiểu kìm hãm phi cạnh tranh

1/v=(Km/Vmax)1/[S] + α'/Vmax

1/v

[I]

-1/Km

không có chất kìm hãm

1/[S]

Hình 6.7. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo

Lineweaver-Burk khi có kìm hãm phi cạnh tranh 111

Cách 3: Kìm hãm hỗn tạp( mixed inhibition )

Hình 6.8. Kiểu kìm hãm hỗn tạp

Trong đó, chất kìm hãm không những liên kết với enzmye tự do

mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS không tạo

được sản phẩm P.

Tương tự như trên ta có phương trình :

1/v= (αKm/Vmax)1/[S] +α'/vmax

1/v

[I]

1/Vmax không có chất kìm hãm

1/[S]

Hình 6.9. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo

Lineweaver-Burk khi có kìm hãm hỗn tạp 112

Các giá trị α ,α' được định nghĩa như trên. Trường hợp α = α' gọi

là kìm hãm không cạnh tranh (noncompetitive inhibition).

Một trường hợp kìm hãm còn gặp nữa là kìm hãm enzyme bằng

nồng độ cao của cơ chất gọi là "kìm hãm cơ chất" như kìm hãm urease khi

nồng độ ure cao, ngoài ra còn có các enzyme khác như

lactatdehydrogenase, carboxypeptidase, lipase, pyrophotphatase,

photphofructokinase (đối với ATP). Nguyên nhân của những hiện tượng

này cón chưa được biết rõ. Đó có thể là:

+ Tồn tại nhiều trung tâm liên kết với cơ chất bằng các ái lực khác

nhau. Khi nồng độ cơ chất thấp thì enzyme có thể chỉ liên kết với một

phân tử cơ chất, còn khi ở nồng độ cơ chất cao nó liên kết với nhiều cơ

chất dẫn đến hình thành phức hợp ES không hoạt động.

+ Cơ chất cũng có thể được liên kết nhờ những vị trí đặc biệt của

enzyme. Đó là một nhóm enzyme quan trọng (enzyme dị lập thể) bên cạnh

trung tâm xúc tác còn có trung tâm điểu chỉnh.

+ Cơ chất có thể liên kết với một chất hoạt hoá và bằng cách này

nó tách khỏi E.

+ Cơ chất có thể choán chổ (ngăn cản) một cofactor ( đồng yếu tố )

hay một coenzyme.

+ Cơ chất có thể ảnh hưởng đến ion lực của môi trường và qua đó

làm mất đi tình chuyên hoá của enzyme.

6.5.4. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa (activator)

Là chất làm tăng khả năng xúc tác nhằm chuyển hóa cơ chất thành

sản phẩm. Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chát hữu

cơ như các vitamin tan trong nươc.

Ví dụ: Mg++

hoạt hóa các enzyme mà cơ chất đã được phosphoryl

hóa như pyrophosphatase (cơ chất là pyrophosphate),

adenosinetriphosphatase (cơ chất là ATP). Các cation kim loại có thể có

tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc vào nồng độ.

6.5.5. Ảnh hưởng cuả nhiệt độ

Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng

nhiệt độ môi trừơng, hiện tượng này tuân theo quy luật Vant'-Hoff. Điều

này có nghĩa khi tăng nhiệt độ lên 100

C thì tốc độ phản ứng tăng lên

khỏang 2 lần.

Đối với phản ứng do enzyme xúc tác cũng có thể áp dụng được

quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định,vì bản chất enzyme là

protein.Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-500

C xảy ra quá trình phá huỷ chất 113

xúc tác. Sau nhiệt độ tối ưu tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác sẽ giảm.

Nhờ tồn tại nhiệt độ tối ưu người ta phân biệt phản ứng hoá sinh với các

phản ứng vô cơ thông thường.

Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối ưu khác nhau, phần lớn phụ thuộc

nguồn cung cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40-600

C , cũng

có enzyme có nhiệt độ tối ưu rất cao như các enzyme của những chủng ưa

nhiệt. Các chủng vi sinh vật ưa nhiệt, đăc biệt các vi khuẩn chịu nhiệt có

chứa enzyme chịu nhiệt cao.

Họat độ

nhiệt độ

Hình 6.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên họat độ enzyme

6.5.6. Ảnh hưởng của pH

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác

nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết với cơ chất và tính chất

hoạt động của phân tử enzyme.Điều này dẩn đến giá trị xúc tác khác nhau

phụ thuộc vào giá trị pH. Như đã biết mỗi enzyme có một pH tối ưu,mỗi

enzyme có đường biểu diễn ảnh hưởng pH lên vận tốc phản ứng do chúng

xúc tác. Đường biểu diễn có dạng như hình sau:

Họat độ

Hình 6.10. Ảnh hưởng của pH lên họat độ enzyme 114

Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể do các cơ sở sau:

a/ Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp.

b/ Ở hai sườn của pH tối ưu có thể xảy ra sự phân ly nhóm

prosthetic hay coenzyme.

c/ Làm thay đổi mức ion hoá hay phân ly cơ chất.

d/ Làm thay đổi mức ion hoá nhóm chức nhất định trên phân tử

enzyme dẫn đến làm thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất và

thay đổi hoạt tính cực đại.

Nhờ xác định Vmax và Km phụ thuộc giá trị pH cho phép nhận

định lại bản chất của các nhóm tham gia vào liên kết cơ chất và quá trình

tự xúc tác.

6.5.7. Các yếu tố khác

+ Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các

bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có

tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất.

Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi,

enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể,

nồng độ enzyme trong dung